几种皮肤特异性表达载体的构建及转基因细胞鉴定

【摘要】羊绒的生长十分复杂,受到环境和遗传因素的共同影响,与毛囊的分化、形成、毛囊周期密切相关,这一过程受到一些抑制绒毛生长基因如FGF5,FGF18等的调控,同时也受到一些促绒毛生长基因如EGF,VEGF等的调控。在绒山羊育种领域,通过转基因技术将外源促绒毛生长基因转入绒山羊体内或者敲除抑制绒毛生长的特定基因,成为提高绒毛产量研究的热点。本研究包括两部分的内容,一是构建皮肤特异性表达Cre重组酶基因载体,以应用于将来条件性敲除抑制绒毛生长的基因；二是构建含有多克隆位点的皮肤特异性表达功能基因的通用载体,为下一步构建皮肤特异性表达促绒毛生长基因的载体提供条件。实验首先采用PCR技术克隆皮肤特异性表达的人表皮角蛋白5启动子(Humkeratin5promoter,K5)和角蛋白14启动子(Humkeratin14promoter,K14)及Cre重组酶基因,之后以pIRES2-EGFP-KAP6载体为基本骨架,通过重组连接,构建了pIRES2-EGFP-KAP6-Cre、pIRES2-EGFP-K5和pIRES2-EGFP-K14等3种皮肤特异性表达的载体；同时构建了含CMV启动子的pIRES2-EGFP-Cre非特异性表达载体；将pIRES2-EGFP-KAP6-Cre和pIRES2-EGFP-Cre两种载体以LipofectamineTM2000介导,分别稳定转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞和皮肤成纤维细胞,筛选转基因细胞系并应用RT-PCR方法检测外源基因的表达。结果表明,PIRES2-EGFP-KAP6-Cre、pIRES2-EGFP-K5和pIRES2-EGFP-K14等皮肤特异性表达载体和含CMV启动子的pIRES2-EGFP-Cre非特异性载体构建成功,载体测序正确,各元件按正确的顺序连接。pIRES2-EGFP-KAP6-Cre,pIRES2-EGFP-Cre载体转染内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞,PCR结果显示外源基因整合到了细胞基因组中。半定量RT-PCR检测pIRES2-EGFP-KAP6-Cre在皮肤成纤维细胞中的表达量高于在胎儿成纤维细胞中的表达量,pIRES2-EGFP-Cre在两种细胞中表达量无明显的区别。本研究成功构建了4种真核表达载体。外源Cre重组酶基因在绒山羊皮肤成纤维细胞中特异性表达。筛选出的稳定表达绿色荧光蛋白,皮肤特异性表达Cre重组酶的转基因绒山羊胎儿成纤维细胞克隆可以为通过转基因克隆技术生产转基因绒山羊提供核供体。
【作者】王靖；
【导师】王志钢；
【作者基本信息】内蒙古大学，生物工程，2014，硕士
【关键词】内蒙古白绒山羊；Cre重组酶；皮肤特异性启动子；转基因细胞克隆；

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